Kandungan
- Pengesanan menggunakan perubahan warna
- Menggunakan pembaca ELISA untuk pengukuran
- ELISA kompetitif secara langsung (cytochrome c)
- Inkubasi antibodi utama dalam tiub
Ujian ELISA adalah sejenis enzim imunosorben yang berkaitan enzim yang menggunakan antibodi atau antigen ditambah kepada enzim tertentu untuk membantu menentukan kepekatan antibodi atau antigen. Jika anda mengambil ELISA dan tidak boleh menggunakan antibodi spesifik untuk mendapatkan keputusan anda, ELISA kompetitif dicadangkan kerana ia menggunakan antigen yang konjugasi kepada enzim dan bukannya antibodi dan kaedah pengesanan yang berbeza.
Pengesanan menggunakan perubahan warna
Satu protokol biasa untuk ELISA yang kompetitif ialah menggunakan antibodi primer yang tidak dilabel dan dibersihkan. Antibodi melapisi telaga salutan microtiter dan diinkubasi dengan standard yang tidak diketahui. Immunogen kemudiannya ditambah untuk konjugasi dengan antibodi utama, yang akan mengikat tapak-tapak antibodi yang belum dijajah. Substrat kemudian digunakan untuk membuat perubahan warna untuk mengukur kepekatan mengikat.
Menggunakan pembaca ELISA untuk pengukuran
Gunakan plat polistirena microtitre dan tambah antibodi utama untuk setiap telaga. Untuk mencapai pengikat maksimum, isikan sumur dengan satu mikrogram antibodi. Inkubasi piring selama empat jam pada suhu bilik. Tambah antibodi tangkapan utama dan basuh telaga dengan PBS (salin buffer fosfat). Plat incubate dengan menghalang penampan selama dua jam pada suhu bilik. Basuh salur dua kali lagi dengan PBS dan tambahkan piawaian. Letakkan larutan antigen-conjugate di dalam telaga dan teruk lagi selama dua jam. Basuh pinggan itu sekali lagi dengan PBS empat kali. Tambahkan substrat dan ukur ketumpatan pada panjang gelombang tertentu menggunakan pembaca ELISA.
ELISA kompetitif secara langsung (cytochrome c)
Untuk ELISA berdaya saing langsung, analisis pencairan serum untuk antigen yang anda gunakan dalam eksperimen mesti dilakukan. Plat microtiter kemudian dilapisi dengan cytochrome c dan diinkubasi semalaman. Bahagian ELISA dari assay kemudian dilakukan dengan penambahan reagen menghalang dan antibodi sekunder. Keputusan penyerapan dibaca dengan pembaca mikplat.
Inkubasi antibodi utama dalam tiub
Dalam prosedur ini, antibodi utama diinkubasi dalam tiub ujian di mana antigen kepentingan mengikatnya. Sampel kemudiannya ditambah ke telaga salutan microtiter dan diinkubasi. Telaga kemudian dibasuh untuk menghilangkan sebarang kompleks antigen-antibodi tak terkondensasi, dan kemudian larutan penyekat ditambahkan untuk menghalang antibodi kedua dari mengikat ke telaga. Antibodi sekunder kemudian dibaca pada pembaca plat untuk mendapatkan hasilnya.